Fermentation technology: comprehensive analysis and prevention measures of contamination

　　1.造成发酵染菌的可能途径有哪些?

　　菌种培养过程操作不当

　　培养基灭菌不彻底

　　发酵设备(如发酵罐、管道)密封不严

　　空气除菌不净

　　2.既然染菌不可避免，哪我们应该怎样做?

　　要提高生产技术水平，强化生产过程的管理，把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生;而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。

　　3.不同发酵过程相对危害最大的杂菌种类?

　　青霉素的发酵 细短产气杆菌

　　链霉素的发酵 细短杆菌、假单孢杆菌

　　四环素的发酵 双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌

　　谷氨酸的发酵 噬菌体

　　柠檬酸的发酵 青霉菌

　　4.不同生产阶段染菌对发酵的影响：

　　种子培养期染菌:对整个发酵过程的危害极大

　　发酵前期染菌：严重干扰生产菌的生长繁殖

　　发酵中期染菌：干扰生产菌的代谢，影响产物的生成

　　发酵后期染菌：影响相对较小

　　5.不同染菌原因对发酵的影响：

　　种子带菌：将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。

　　空气带菌：使发酵大面积染菌

　　培养基或设备灭菌不彻底：一般不具延续性，使单个(批)发酵罐发酵失败

　　设备渗漏：染菌几率较大

　　6.发酵异常现象及染菌原因分析：

　　(1)溶解氧的异常变化

　　当杂菌是好气性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至接近于零，且在

　　长时间内不能回升;

　　当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧

　　升高。

　　(2)排气的CO2异常变化

　　如杂菌污染时，糖耗加快， CO2含量含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化判断染菌。

　　(3)其它异常现象：

　　如菌体生长不良、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。

　　7.染菌原因分析：

　　(1)从染菌的规模来分析染菌原因

　　大批发酵罐染菌：空气系统

　　部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的

　　个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象

　　个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

　　(2)从染菌的时间来分析

　　发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角

　　中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理

　　(3)从染菌的类型来分析：

　　耐热性芽孢杆菌：死角或灭菌不彻底

　　球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的

　　浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏

　　霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格

　　设备渗漏的原因：当设备渗漏时，往往每批染菌发生的时间逐渐提前

　　a发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀

　　b磨蚀

　　c设备加工不良

　　盘管渗漏的防止：

　　放罐后要认真清洗发酵罐

　　控制冷却水质量，降低其中氯离子含量

　　对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙

　　试漏方法：气压试验 水压试验

　　空气分布管渗漏的防止

　　④罐体渗漏的防止

　　⑤管件的渗漏

　　(4)管路的连接：

　　螺纹连接 法兰连接 焊接

　　(5)空气过滤系统方面原因：

　　原因分析：进风口、生产环境、空气过滤器

　　染菌特点：空气过滤系统带菌会使发酵罐批批染菌、罐罐染菌，此时就要对空气过滤系统进行无菌样检测

　　8.染菌的检查和判断

　　无菌试验方法

　　显微镜检查法(镜检法)

　　肉汤培养法

　　平板划线培养或斜面培养检查法

　　④发酵过程的异常现象观察法

　　如果肉汤连续三次发生变色反应(由红色变为黄色)或产生混浊，或平板培养连续三次 发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。

　　9.杂菌污染的挽救及处理：

　　(1)种子培养期染菌：应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌

　　(2)发酵前期染菌：营养成分消耗不多，应迅速重新灭菌;另处，补充必要的营养成分， 重新接种进行发酵。

　　(3)发酵中、后期染菌：可以加人适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度;产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。

　　(4)发酵后对设备的处理：空罐加热灭菌后至120℃以上、30min后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理

　　10.杂菌污染的途径和防治：

　　(1)种子带菌及其防治：

　　原因分析：种子保存 种子培养设备 种子换代及接种 种子培养基

　　防治措施：

　　检查发生污染所用的保藏菌种。

　　检查发生污染的种子罐接种所用的三角瓶等器皿。

　　检查对三角瓶、棉花塞、培养基等所进行的灭菌操作。

　　检查天菌锅的工作情况，校核温度表和压力表。灭菌锅工作时锅内空气务必排尽。

　　检查无菌室的无菌状况，特别是接种箱。检查接种箱所用的杀菌熏剂。

　　检查操作人员的操作技术。

　　对杂菌或噬菌体进行微生物检验。

　　(2)空气带菌及其防治：

　　防治措施：

　　油渗入空气：改用无油润的压缩机。

　　列管式冷却器穿孔。

　　过滤介质松动，空气走短路。

　　过滤介质被水润湿。

　　过滤介质老化.

　　(3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治：

　　设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀电化学腐蚀磨浊摊口金属与原料中的泥沙之间磨损、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。

　　“死角”包括了发酵设备或连接管道的某一部位和培养基或其他物料的某一部分等。

　　盘管的渗漏染菌及防治：

　　原因分析：由于存在温差(内冷却水温、外灭菌温)，温度急剧变化，或发酵液的pH低、化学腐蚀严重等原因。

　　防治措施：生产上可采取仔细清洗，检查渗漏，或降低冷却水中Cl-1的含量等措施加以防治。

　　空气分布管的“死角”染菌及防治：

　　原因分析：受搅拌与通所的影响，易磨蚀穿孔

　　防治措施：采取频繁更换空气分布管或认真洗涤等措施

　　发酵罐的渗漏染菌及防治：

　　原因分析：

　　发生局部化学腐蚀或磨蚀，产生穿孔渗漏。

　　罐焊接处等的周围容易积集污垢。

　　发酵罐的制作不良。

　　发酵罐封头上的各个接口。

　　发酵罐的修补焊接位置不当。

　　防治措施：

　　采取罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等是有效消除染菌的措施。

　　采用不锈钢或复合钢可有效克服此弊端并注意清洗是可以避免染菌的。

　　④管路的安装或管路的配置不合理形成“死角”：

　　原因分析：

　　经常将一些管路汇集到一条总的管路上。管路大多采用法兰连接。

　　防治措施：

　　采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。

　　法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求尽可能减少或取消连接法兰等措施

　　⑤管件的渗漏形成染菌及防治：

　　(4)生产原料灭菌不彻底导致的染菌：

　　*原因分析：

　　淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生”，蒸汽不易进入将杂菌杀死

　　培养基中诸如麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多，在投料时溅到罐壁或罐内的各种支架上，容易形成堆积，这些堆积物在灭菌过程由于传热较慢，一些杂菌也不易被杀灭。

　　*防治措施：

　　升温前先通过搅拌混合均匀，并加人一定量的淀粉酶进行液化;有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌;

　　对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。

　　*具体措施：

　　购进原料应干燥，仓贮原料应保持干燥。

　　制各培养基时，粉碎原料先用冷水浸润，调浆罐搅拌要充分防止结块。

　　粉碎原料颗粒应足够小，大颗粒会影响杀菌效果。

　　④假如生产原料被孢子严重污染，制成培养基后，可在30℃保温数小时，待孢子

　　发芽后再行杀菌。

　　(5)操作不当造成染菌及其防治：

　　*原因分析：

　　灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”。

　　产生泡沫发泡严重时泡沫可上升至罐顶甚至逃逸，以致泡沫顶罐。

　　连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间没有符合灭菌的要求。

　　④探头或元件灭菌方法不当。

　　*防治措施：

　　灭菌升温前打开排气阀，排尽冷空气。

　　加入消泡剂进行消泡处理。

　　连续灭菌过程中，避免蒸汽压力的波动过大，严格控制灭菌温度。

　　探头或元件保证灭菌彻底。

　　(6)噬菌体污染及其防治：

　　防治措施：

　　认真保藏好生产菌株，确保其不受污染。

　　严禁活菌体排放。

　　强化设备管理。

　　加强环境卫生工作。

　　加强对无菌空气，空间杂菌及噬菌体监测工作。

　　*感染噬菌体后采用的理方法:

　　选育抗性菌株。

　　轮换使用专一性不同的菌株。

　　加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸钠，0.6%柠檬

　　酸钠或铵等)。

　　④将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，70~80˚C经5分钟即可杀死)

　　⑤其他方法